3D打印技術制備生物醫用高分子材料的研究進展

新加坡南洋理工大學的Hutmater等使用PCL為原料，通過FDM技術制備了蜂窩狀、內部完全貫通的可降解3D組織工程支架，材料的通道尺寸為160～700μm，孔隙 率為48%～77%．材料的壓縮硬度可從4～77MPa范圍內變化，而屈服強度為0.4～3.6MPa，屈服應變為4%～28%．材料的孔隙率與壓縮性質具有高度的相關性．人初級成纖維細胞與材料共培養后， 3～4周后發現細胞完全充滿支架的空隙．當將表面含有骨髓間充質細胞的3D支架移植到豬眼眶的創口后，獲得比沒有支架材料或沒有種植細胞的支架更好的新骨形成效果  ．南洋 理工大學的Teoh等以PCL為原料，利用FDM技術制備了骨軟骨復合支架，并將成骨細胞與軟骨細胞分別種植于支架的兩部分。
 

2種細胞在支 架中分泌出不同的細胞外基質，在成骨細胞種植區出現了較高的骨鈣，而軟骨細胞種植區測得了較高的堿性磷酸酶．該結果表明，這種3D打印的PCL支架可望應用于骨軟骨修復方面． 荷蘭烏特勒支藥學研究所Hennink等使用芐基保護的羥甲基乙交酯（BMG）與己內酯（ε-CL）共聚，然后再進行芐基脫保護，獲得了羥甲基乙交酯（HMG）與ε-CL的共聚物（PHMGCL），并通過纖維熔體沉積技術制備了3D支架．側鏈羥 基的引入增加了材料的親水性和降解速率，并增強了細胞對材料的黏附， 促進了人間充質干細胞的存活和增值， 以及成骨分化．PHMGCl（HMG∶Cl=8∶92）3D支架經皮下移植到Balb/c鼠體內后，PHMGCl支架在3個月內重量損失達到60%，PHMGCl的分子量也出現了明顯的降低，而PCL支架則沒有出現明顯的重量損失．另外， 材料移植到鼠體內后引起了溫和的炎性反應，局部出現了巨噬細胞、淋巴細胞和纖維化．在動物皮下，PHMGCl支架比PCL支架具有較高的血管生成效果． 韓國浦項科技大學的Cho等以PCL/PLGA為原料，使用一種多頭沉積技術，制備了復合3D支架  ．材料具有600μm的孔徑和69.6%的孔 隙率，壓縮強度和模量分別為0.8和12.9MPa，材料在細胞實驗過程中能夠維持初始結構．另外，多頭沉積技術還能有效地在3D支架中填充入水凝膠， 而水凝膠可以作為生長因子或細胞的理想載體載入3D支架中  ．經過貽貝黏附肽（尤其是結合RGD后）修飾的PCL/PLGA三維支架能提高人脂肪衍生干細胞的黏附、增值和成骨分化，并促進動物體內顱骨缺損部位的骨再生 。
 

另 外， 聚（L-丙交酯-ε-己內酯）（PLLACL）無規共聚物也被用于3D纖維沉積技術制備生物降解支架 ． 其他聚酯材料也被用于FDM技術制備可降解支架材料．荷蘭屯特大學的Woodfield等以生物可降解的聚乙二醇-對苯二甲酸酯/聚對苯二甲酸丁二醇酯（PEGT/PBT）嵌段共聚物為原料，以6月大的新西蘭白兔股骨遠端和脛骨近端關節的三維CT成像數據為模型，利用3D纖維沉積技術分別制備了兔股骨和脛骨修復支架， 并將從兔自身提取的軟骨在支架上培養一段時間后，移植到兔的關節缺損部位進行原位關節修復 ．移植6周后，支架分別與股骨和脛骨結合，然而，形成的纖維軟骨狀組織， 還沒有達到移植軟骨的效果，
     聚酯與無機粒子的復合物也能用于熔融沉積成型制備3D支架材料．在原料中加入20%的磷酸三鈣（TCP）后，能促進人間充質干細胞（hMSCs）的增殖與成骨分化．當載有hMSCs細胞的PCL-TCP支架移植到裸鼠股骨缺損部位后，hMSCs能在移植3周后保持存活，然而，只有50%的股骨缺損部位有新骨生成．在PCL-TCP三維支架中載入15%的慶大霉素（PT15）后，能有效地在2h內消除細菌，而且沒有出現明顯毒性  ．當使用PT15來處理感染的鼠全層傷口時， 也能有效地消除創口的細菌．另外， PT15處理的實驗組沒有出現明顯的整體感染，能有效地促進傷口愈合．PLGA/TCP復合3D支架移植到兔股骨缺損部位12周后，表現了良好的骨誘導性能，并且材料逐漸降解  ．然而，進一步在支架表面添 加羥基磷灰石組分并沒有對材料的降解與骨形成產生顯著影響．另外，同時載有成骨細胞與人臍靜脈內皮細胞的PCL/PLGA/TCP復合3D支架在移植到鼠顱骨缺損12周后， 同時載有兩種細胞的3D支架比只載有一種細胞的支架具有更好的促新骨形成效果  ．
選擇性激光燒結 
    選擇性激光燒結（SLS）是采用激光束按照計 算機指定路徑掃描，使工作臺上的粉末原料熔融、粘結固化．當一層掃描完畢，移動工作臺，使固化層表面鋪上新的粉末原料， 經過逐層掃描粘結，獲得三維材料．與SLA技術通過紫外光逐層引發液態樹脂原料發生聚合或交聯反應不同，SLS技術是通過激光產生高溫使粉末原料表面熔融、相互粘結來形成三維材料．SLS技術常用的原料包括塑料、 陶瓷、金屬粉末等．其優點是加工速度快，且無需使用支撐材料，但缺點是成型產品表面較粗糙，需后處理，加工過程中會產生粉塵和有毒氣體，而且持續高溫可能造成高分子材料的降解，以及生物活性分子的變形或細胞的凋亡，該技術不能用于制備水凝膠支架．以生物可降解高分子為原料， 利用SLS技術，也是制備外部形態和內部結構可控3D醫用高分子材料的有效途徑。
 
       對支架性能產生影響的主要參數包括顆粒尺寸、激光能量、激光掃描速率、部分床層溫度等 美國密歇根大學的Das等使用PCL為原料，通過SLS技術制備了3D可降解多孔支架，支架材料的壓縮模量和屈服強度分別為52～67MPa和2.0～3.2MPa，該結果達到或接近了人松質骨力學性質范圍  ．獲得的3D支架材料能與動物 骨組織良好的結合，具有良好的生物相容性．按照豬的下頜髁突原型， 制備了PCL下頜髁突支架．使用NaCl等致孔劑，可獲得具有高孔隙率的3D支架材料 ．通過在原料中加入80wt%的NaCl， 可以獲得孔隙率高達90%的3D支架材料，并形成了約1mm的內部通道結構．經過實驗后處理，99.99%的致孔劑可以被浸提出來．降低激光源能量，可獲得具有較低壓縮硬度的成型材料  ．較 低力學強度的支架材料可以用于某些軟組織工程修復（如心臟組織工程等）．將C2C12成肌細胞與壓縮硬度為345kPa的PCL三維支架共同培養21天后，發現細胞分布于支架的整個區域，培養11天后，觀察到C2C12的融合和分化．SLS技術制備的PCL三維支架也可以用于藥物控制釋放的載體。
 
      以亞甲基藍為模型藥物，與PCL制備 成含有多層同心環結構的圓柱型藥物控制釋放器件，聚合物和亞甲基藍均一分布于基質中，且初期突釋行為可以通過增加同心環的數目而降低，模型藥物從該器件中主要以擴散機理釋放．另外，由于SLS技術操作過程中會產生高溫，因此為了減少可降解高分子原料（如PCL、 PLA等）在加工過程中發生降解，或造成原料中的生物活性分子變 性， 開發了一種表面SLS技術 ．該技術可以控制燒結過程中只融化顆粒的表層原料． 通過制備聚酯與納米羥基磷灰石（HA）的復合微球，或直接將聚酯粉末與HA粉末共混，通過SLS技術燒結，可以獲得聚酯/HA的3D復合材料 ．南洋理工大學的Wiria等利用SLS技術， 將尺寸為125～250μm的PLGA（95/5）和HA或HA/TCP混合粉末燒結，制備了人第四中節指骨支架模型 ．香港大學Wang等以聚（羥基丁酸 酯-羥基戊酸酯）（PHBV）/磷酸鈣（Ca-P）納米復合微球為原料，制備了人近端股骨髁3D多孔支架  ．并通過對支架材料使用明膠/肝素進行表 面修飾，并載入重組人骨形成蛋白-2（rhBMP-2），顯著促進了的細胞的堿性磷酸酶活性和成骨分化． 除了以生物可降解聚酯為原料，也可以使用生物相容的非生物降解高分子為原料（例如聚醚醚酮（PEEK）、聚乙烯醇、高分子量聚乙烯、尼龍-6等）  ，以及它們與HA的復合材料 ， 通過SLS技術，制備可以適合于臨床使用的個性化假肢等骨修復或骨替代材料.
3D噴印 
3D噴印（3DP）技術是在基底表面鋪上薄層 粉末原料，然后通過計算機CAD模型控制噴頭按照指定路徑將液態粘結劑噴在粉末的設定區域，該層粉末粘結后上下移動操作臺，并在粘結層表面鋪上新的薄層粉末， 通過逐層粘結，最后除去未粘結的粉末原料， 獲得三維原型材料．3DP技術操作簡便、產品具有高孔隙率、原料應用范圍廣，其缺點是產品力學強度較低，產品需進行后處理、只能使用粉末原料等．美國Therics公司的Sherwood等通過3DP技術，制備了上層組分為PLGA/PLLA，下層為PLGA/TCP的軟骨-骨復合支架  ．上層軟骨支架區的孔隙率為90%，而下層 成骨區孔隙率控制在55%．研究發現軟骨細胞更傾向于黏附于支架的軟骨支架區，培養6周后可以看到軟骨組織的形成．支架的成骨區力學強度可以達到與人新生松質骨同一數量級．該研究為完全關節重建技術提供了一種新的方案．

直接攜帶細胞打印的生物打印技 術 
直接通過3D打印技術控制細胞在微觀尺度 的排列分布， 對于調節細胞行為、細胞間的相互作用、細胞與材料間的相互作用，以及促進細胞最終形成功能組織具有十分重要的意義．另外，相比于在已成型的支架中種植細胞，直接攜帶細胞打印可以獲得更高的細胞密度．因此， 近年來通過直接攜帶細胞進行3D打印的細胞或組織打印技術受到了廣泛的關注．由于水凝膠與天然軟組織細胞外基質在結構、 組成和力學性質上的相似性，目前的細胞和組織打印技術主要是基于攜帶細胞的水凝膠的3D沉積技術  ．對于3D打印成型的攜 帶細胞水凝膠支架的基本要求包括：
（1）水凝膠在工作臺沉積后能快速原位成型，并維持初始沉積的形狀；
（2）保持細胞活性和功能；
（3）打印成型的支架容易進行后處理．
    目前一種常用的細胞打印技術是以雙鍵封端的PEG（如PEG-DA或甲基丙烯酸酯封端的PEG（PEG-DMA））水溶液與含有細胞的培養液混合，形成可光固化高分子/細胞混合溶液，然后通過立體印刷技術，打印成型包覆細胞的3D水凝膠 ．為了提高水凝膠骨架與細胞間的相互作 用，可以在原料中引入等生物活性分子修飾的共聚單體．例如，引入RGD修飾的共聚單體 后， 可以明顯促進水凝膠內細胞的存活和生長  ．美國斯克里普斯研究所的D’Lima等以天然牛股骨髁制成體外軟骨缺損模型，以PEG-DMA/軟骨細胞混合溶液為生物墨水，在紫外光照下， 在軟骨缺損部位進行原位打印 ．該方法 打印成型的PEG水凝膠的壓縮模量與天然關節軟骨接近．打印后軟骨細胞能在水凝膠支架內均勻分布，而且細胞存活率要比生物墨水先沉積后再進行光照聚合的成型方法高26%．值得注意的是， 打印后支架能與周圍的天然組織緊密結合，該性質對于未來體內組織缺損的原位修復非常重要．
     該方法為開發能直接應用于體內的原位生物打印技術，進行組織缺損原位修復提供了一個重要的手段．除了通過上述光聚合反應，其他生物相容的原位凝膠成型技術也被用于3D細胞打印．例如，可以將藻酸鹽與細胞的混合溶液打印成型后，再 在CaCl2溶液中浸泡，使得藻酸鹽與Ca2+形成穩 定的離子交聯網絡 ．研究發現，攜帶人心肌 祖細胞（hCMPCs）的3D生物打印成型的支架，在體外培養1天和7天時，支架內的細胞存活率達92%和89%，hCMPCs能維持原有的功能，而且通過3D支架培養提高了早期心臟轉錄因子的表達．前期實驗結果表明，該技術可望在心臟組織工程中獲得應用．另外， 利用凝血的原理，可將含有細胞的凝血酶溶液作為生物墨水，噴入以纖維蛋白原溶液為生物紙的基質中，通過原位凝固形成包裹細胞的纖維蛋白支架 ．而且，纖維蛋白本 身具有促進血管生成的性質，也是骨骼/平滑肌細胞和軟骨細胞的理想支架材料．實驗證明，該技術打印成型的細胞支架能促進人微血管內皮細胞的增殖和微血管形成．
    此外，膠原也是一種應用廣泛的組織工程支架材料．將含有細胞的膠原在較低pH下進行打印后，再在支架表面噴灑碳酸氫鈉溶液使體系的pH升高至中性，促使膠原發生自身物理凝膠化， 形成穩定的3D細胞支架．哈佛醫學院的Yoo等利用該技術制備了分別含有內部纖維原細胞和外部角質細胞的雙層細胞支架，發現兩層細胞都維持了高的細胞活性．這種多層細胞 打印技術為將來直接進行更為復雜的組織打印技 術奠定良好的基礎．

結論
     以上文章主要總結了近年來3D打印技術應用于 生物醫用高分子材料制備方面的研究進展，比較了不同3D打印技術各自的優勢和局限性，并對3D成型高分子支架材料在細胞培養或動物模型的組織修復方面的應用進行了討論．目前常用的幾種3D打印技術都具有各自的優勢和局限性．光固化立體印刷技術制備的3D材料精度高、力學強度較高， 但在后處理除去有機溶劑等雜質過程中需要避免成型產品發生變形．熔融沉積成型技術制備的成型產品精度高、表面質量好，但是需要高溫將原料熔融．選擇性激光燒結技術的優勢則是加工速度快、無需使用支撐材料，其缺點是高加工溫度、成型產品表面粗糙等．另外，3D噴印技術操作簡單、 快速成型、制備條件溫和，然而，其成型產品的力學強度較低．因此， 在選擇不同方法制備三維高分子支架材料時，還需結合原料的特點以及對成型產品的性能要求．
    目前， 3D打印技術在硬組織工程支架材料的制備方面獲得了較多的關注和研究進展．然而，總的來說， 3D打印技術在生物醫用高分子材料的制備領域仍處于初始階段．要實現3D打印技術在臨床的應用還面臨很多挑戰．首先對于高分子原料的選擇是影響3D成型材料應用的重要因素，其中主要包括高分子的生物相容性、生物響應性、降解性能、力學性質等．此外，在3D打印及后處理過程中需要保持成型材料的生物相容性，以及表面或內部細胞的存活率．最后，需要闡明細胞在3D支架材料內部的黏附、生長和分化的機制，尤其是材料與細胞相互作用的機制．


部分文章來源：3D打印技術制備生物醫用高分子材料的研究進展 *（賀超良 湯朝暉 田華雨 陳學思 中國科學院長春應用化學研究所中科院生態環境高分子材料重點實驗室 ）